BGISEQ-500 RNA-Seq发Cell！是真的，但没那么简单……

国际顶尖学术刊物Cell（《细胞》，影响因子30.4）近期发表了浙江大学医学院免疫学研究所、中国工程院院士曹雪涛研究团队的论文——《Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity》（《甲基转移酶SETD2介导的STAT1甲基化修饰在IFN的抗病毒免疫中起关键作用》）。

文献解读

全球有超过3.5亿乙肝病毒（HBV）感染患者，其中约1/3在中国。除了接种疫苗，目前广泛使用抗病毒天然免疫细胞因子IFNα（I型干扰素）治疗，但效率低。

为揭示HBV感染情况下IFNα信号通路调控的分子机制，研究团队通过高通量小RNA干扰筛选体系筛选了711个已知的表观遗传修饰基因，发现组蛋白甲基转移酶SETD2表达对于干扰素抵抗HBV至关重要。通过肝细胞特异性敲除SETD2基因的小鼠模型，确定SETD2增强干扰素抑制HBV作用。发现SETD2分子通过其SET结构域发挥甲基转移酶活性，直接催化信号蛋白STAT1的第525位赖氨酸发生单甲基化修饰，从而促进干扰素效应信号的活化。此外，SETD2选择性地催化干扰素诱导性基因远端启动子区发生组蛋白H3K36me3的修饰，从而直接促进这些具有抗病毒作用基因的转录活化和表达。

该研究揭示了SETD2分子直接催化信号蛋白STAT1甲基化修饰的新机制，为病毒感染性疾病的治疗提供了新靶点。

实验方法有19项之多，如siRNA库高通量筛选、赖氨酸甲基化质谱分析、RNA干扰、 qRT-PCR分析、流式细胞分析、ELISA、Western杂交、 Pull-down试验、体外甲基化分析、免疫荧光、ChIP、RNA-Seq等。

科技君要划重点的是，RNA-Seq由BGISEQ-500平台完成。

BGISEQ-500平台助力RNA表达研究

样品选择：

4组不同的人细胞样品，每组2个生物学重复，共8个样品。

测序方法：

BGISEQ-500 RNA-Seq。

主要结果：

1、SETD2经SET域（包含片段）促进STAT1活化，从而提高干扰素诱导的抗病毒功能

HepG2细胞中敲除SETD2，产生出3个SETD2-KO细胞系，呈现出SETD2表达缺失和总的H3K36me3水平下降（图1F），与对照HepG2相比，都表现出干扰素诱导的STAT1磷酸化作用受损（图1G）。观察干扰素处理的SETD2-KO HepG2细胞，IFNAR1/R2或 STAT1上游信号分子的表达没有显著差异。通过RNA-Seq分析，发现一系列ISGs响应干扰素刺激，在SETD2-KO细胞比HepG2 WT细胞表达更低（图1H）。qRT-PCR分析确定干扰素刺激后在SETD2-KO细胞中两个ISG表达降低，包括ISG15 和MX2（图1I）。所以，在干扰素刺激下，SETD2提高STAT1磷酸化作用和ISG表达。

图1  SETD2促进干扰素诱导的STAT1 磷酸化和 ISGs 表达

F  IB分析对照和SETD2-KO细胞全细胞溶解产物中SETD2、H3K36me3和Histone3

G  IB分析对照和SETD2-KO细胞刺激后不同时间点全细胞溶解产物中磷酸化STAT1、磷酸化STAT2、STAT1、STAT2、H3K36me3和 Histone3

H  HepG2细胞和SETD2-KO细胞干扰素刺激6小时，相比于没有干扰素刺激的细胞，上调基因的热图

I  qRT-PCR分析在对照和SETD2-KO HepG2细胞中受干扰素刺激下ISG15和MX2表达

2、SETD2选择性促进H3K36me3修饰的ISGs表达

利用RNA-Seq，在SETD2-KO细胞、STAT1-K525A-Re细胞、STAT1-KO细胞以及对照的HepG2 细胞在干扰素刺激下6小时（图2A）。干扰素刺激后对照HepG2细胞中222个基因被诱导，SETD2-KO 细胞、STAT1-K525A-Re细胞和STAT1-KO 细胞，与对照HepG2细胞相比，分别有89、128和180个基因显著性下调（图2B）。

GO富集分析显示SETD2-KO 细胞和 STAT1-K525A-Re细胞中，表达更低的基因被归类于病毒的防御反应或I型干扰素通路相关基因（图2C）。STAT1-KO细胞在干扰素刺激下下调的180个基因，其中有40%在SETD2-KO细胞的干扰素刺激下也表达更低，包括SETD2促进一系列的STAT1依赖的ISG（图2D）。

另外，在干扰素刺激后的SETD2-KO 细胞和STAT1-K525A-Re细胞中，75个基因表达更低，包括有抗病毒功能的ISGs，比如ISG15、ISG20、MX2等（图2D和2E）。进一步确定了SETD2介导的ISGs调控，在很大程度上依赖于在介导STAT1 K525单甲基化中起到的作用。

图2  SETD2选择性催化一些ISGs的 H3K36me3 修饰

A  干扰素刺激6小时，HepG2、SETD2-KO、K525A-Re和STAT1-KO细胞中ISGs mRNA表达热图

B  SETD2-KO、K525A-Re和STAT1-KO HepG2细胞相对于对照HepG2细胞的差异诱导基因统计

C  GO分析干扰素刺激6小时，SETD2-KO、K525A-Re与对照HepG2细胞相比的差异表达基因

D  干扰素刺激6小时，SETD2-KO、K525A-Re和STAT1-KO的差异表达基因维恩图

E  干扰素刺激下SETD2-KO（左）、K525A-Re（右）细胞相对于对照HepG2细胞抑制表达基因散点图。灰点代表两种细胞中表达没变化，红点代表选择的ISGs在两种细胞中都表达更低，绿点代表其他基因。

总之，研究样品间基因表达差异情况， BGISEQ-500 RNA-Seq提供了差异表达基因表达量热图、基因数量统计图、维恩图、GO富集分析、散点图等。这些图华大基因的结题报告里都有，科技君突然觉得发Cell不是一个遥远的梦……

然而，事情没那么简单！实验路上的坑还有很多。就说第一步，您需要足够的样品量。样品量少，建库容易失败，珍贵的样品被白白浪费；即使建库成功，建库操作人员水平一般，数据质量差，定量结果不靠谱。

而样品量实在没有那么多的老师，怎么办？我们还有“避坑神器”——

微量建库！

BGISEQ-500 RNA-Seq真核样品总RNA建库起始量，从ng到pg，降低到1/1000，微量样品定制化建库，解决样品量不足无法建库的尴尬。

三大优势

样品起始量低：200pg

建库成功率高：>95%

交付周期短：30个自然日

两大突破

风险高？ 操作难度太高，珍稀样品被浪费，数据质量没保障？

No！多位经验丰富技术专家，上千个定制化项目成功经验，几乎做过所有您能想到的样品，专治疑难杂症，建库成功率高、结果灵敏且可靠！

流水线？ 每个样品都大不同，都用一样的流程建库怎么能行？

No！每个项目一对一方案，个性化的实验操作，针对样品不同物种、部位、状态、环境、采集方法、保存方式、提取操作、样品总量和质量等，甄选最合适的建库方法！

项目数据展示

3组*3个生物学重复的人样品BGISEQ-500 RNA-Seq微量建库数据展示：

样品情况：

来源于某医院人样品，总RNA样品量200pg~100ng，数据量20 M clean reads/样品。

基因检测灵敏度：

样品全部达到鉴定到的基因数目>15,800个，极低表达水平基因>4,000个，较低表达水平基因>6,000个（图3）。

图3 基因表达量分布图

X轴表示样品名称，Y轴表示基因数目，颜色深浅表示不同表达量水平：FPKM ≤ 1的为极低表达水平的基因，FPKM在1-10之间的为较低表达水平的基因，FPKM ≥ 10的为中高表达水平的基因

定量结果可靠性：

A~C代表组，1~3代表每组中3个生物学重复。重复样品间基因表达的Pearson相关性>0.95，组间样品也相关性与预期相符（图4）。

图4 样品间相关性分析热图

X、Y轴均代表样品名称，颜色代表相关性系数：颜色越蓝代表Pearson相关性越高，颜色越浅代表相关性越低

参考文献：

Chen K, Liu J, Liu S, Xia M, Zhang X, Han D, Jiang Y, Wang C, Cao X. Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity. Cell. 2017 Jul 27;170(3):492-506.e14. doi: 10.1016/j.cell.2017.06.042.

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撰稿：赵    青

编辑：市场部

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